弗洛里和钱恩在1940年用青霉素重新做了实验。他们给8只小鼠注射了致死剂量的链球菌，然后给其中的4只用青霉素治疗。几个小时内，只有那4只用青霉素治疗过的小鼠还健康活着。此后一系列临床实验证实了青霉素对链球菌、白喉杆菌等多种细菌感染的疗效。青霉素之所以能既杀死病菌，又不损害人体细胞，原因在于青霉素所含的青霉烷能使病菌细胞壁的合成发生障碍，导致病菌溶解死亡，而人和动物的细胞则没有细胞壁。1940年冬，钱恩提炼出了一点点青霉素，这虽然是一个重大突破，但离临床应用还差得很远。1941年，青霉素提纯的接力棒传到了澳大利亚病理学家瓦尔特弗洛里的手中。在美国军方的协助下，弗洛里在飞行员外出执行任务时从各国机场带回来的泥土中分离出菌种，使青霉素的产量从每立方厘米2单位提高到了40单位。1941年前后英国牛津大学病理学家霍华德·弗洛里与生物化学家钱恩实现对青霉素的分离与纯化，并发现其对传染病的疗效，但是青霉素会使个别人发生过敏反应，所以在应用前必须做皮试。所用的抗生素大多数是从微生物培养液中提取的，有些抗生素已能人工合成。由于不同种类的抗生素的化学成分不一，因此它们对微生物的作用机理也很不相同，有些抑制蛋白质的合成，有些抑制核酸的合成，有些则抑制细胞壁的合成。
弗莱明要遇到青霉菌所致的溶菌现象，究竟需要多少偶然因素之间的相互配合才能出现。有人曾为此专门著文阐述。首先，青霉菌适合在较低温度下生长，葡萄球菌则在37度下生长最好。其次，在长满了细菌的培养基上，青霉菌无法生长。最后，青霉菌大约在5天后成熟，这时青霉素才会出现，而青霉素也只对快速生长中的葡萄球菌有溶菌作用。
成就保障因此，弗莱明的发现，至少需有下述三方面的条件作保障。
1、来源不明的青霉菌孢子落入葡萄球菌中。
2、弗莱明未将培养基放在37摄氏度的温箱中，也未清洗，而是放置在室温下。
3、天气的配合。当年的气温记录显示，恰好在7月28至8月10，伦敦有一段十分难得的凉爽天气，极其适合青霉菌先行生长成熟，并产生了青霉素。而8月10号以后，气温则明显升高有利于葡萄球菌快速生长，以至于发生了溶菌现象。
4、或许还要加上，在弗莱明刚进实验室，尚未着手清洗时，其前任助手恰好到来叙旧。
